[생화학] PCR의 원리 및 실험 방법 (principle & protocol)

 

주요 생화학 실험법: Polymerase Chain Reaction (PCR)

 

이번 글에서는 분자생물학 및 생화학 연구에서 빼놓을 수 없는 두 가지 핵심 기술인 Polymerase Chain Reaction (PCR)에 대해 깊이 있게 다뤄보고자 합니다.

 

PCR 기술은 생물학 연구뿐만 아니라, 의료 진단, 법의학, 그리고 환경 분석 등 다양한 분야에서 중요한 역할을 합니다.

 

이 기법은 유기체 내에 존재하는 DNA의 특정 서열을 정밀하게 증폭시키는 실험 방법으로, 특히나 샘플 중에 소량으로 존재하는 DNA나 RNA의 양을 정량화하거나 증폭하는 데 사용됩니다.

 

최근에는 코로나19 진단을 비롯하여 미생물의 16S rRNA 분석을 통한 종 분리 연구에까지 그 응용 범위가 확대되고 있습니다.

특히, PCR은 코로나 바이러스의 특이적 DNA 서열을 목표로 한 프라이머를 사용하여 인체에서 채취한 샘플(주로 비인두도말물)로부터 바이러스의 DNA 서열을 증폭시킴으로써 감염 여부를 확인하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 

 

또한, 16S rRNA는 종 간 구별에 필수적인 도구로 활용되며, 그 보전성과 짧은 길이로 인해 염기서열 분석(sequencing)에 이상적입니다.

 

PCR 진행 방식에 따른 종류

 

PCR은 실험의 목적과 설정에 따라 여러 종류로 분류됩니다:

 

1) One-step PCR

One-step PCR에서는 모든 필요한 성분들을 하나의 반응 용액에 섞어서 PCR을 수행합니다. 이 방법에서는 역전사 효소와 DNA 중합효소를 포함한 모든 반응물을 한 번에 혼합하여 PCR 사이클을 시작합니다.

 

주로 RNA 타겟을 기반으로 할 때 사용되며, RNA를 DNA로 전사하는 역전사 과정과 DNA를 증폭하는 PCR 과정이 연속적으로 이루어지는 것이 특징입니다.

장점으로는 과정이 간단하고, 시간 및 노력을 절약할 수 있습니다. 샘플 오염의 위험이 더 낮을 수 있습니다.

단점으로는 역전사 효소와 DNA 중합효소 간의 최적 조건의 차이로 인해 효율성이 떨어질 수 있습니다. 반응 조건의 융통성이 낮습니다.

 

2) Two-step PCR

Two-step PCR에서는 역전사 과정과 PCR 과정을 분리하여 수행합니다. 먼저 RNA를 cDNA(보완 DNA)로 전사하는 역전사 반응을 수행한 후, 이 cDNA를 템플릿으로 사용하여 별도의 PCR 반응을 진행합니다. 이 방법은 RNA 타겟을 다룰 때 주로 사용됩니다.

장점으로는 각 단계에서 최적의 조건을 설정할 수 있어, 효율성과 특이성이 높아집니다. 다양한 PCR 애플리케이션에 더 유연하게 적용할 수 있습니다.

단점으로는 과정이 복잡하고, 더 많은 시간과 노력이 필요합니다. 샘플 오염의 위험이 더 높을 수 있습니다.

 

 

PCR의 기본 원리

 

PCR의 기본 원리를 살펴보면, 다음 세 단계로 나눌 수 있습니다:

 

1. 변성 단계 (Denaturation)
   
   이 단계에서는 DNA 이중 나선 구조가 92~98도의 온도에서 분리됩니다. 이 온도에서 DNA polymerase가 비활성화되지 않도록 보통 95도에서 진행합니다.
   
   
2. 풀림 단계 (Annealing)
   
   DNA의 염기 서열이 노출되면, 20bp 내외 크기의 뉴클레오타이드 조각이 특정 서열에 상보적으로 결합합니다. RNA 샘플의 경우, cDNA를 만드는 추가 작업이 필요합니다. 이 과정에서 프라이머의 Tm(녹는 온도) 값을 고려하여 적절한 온도에서 반응시킵니다.
   
   
3. 확장 단계 (Extension): DNA polymerase의 활성이 최대가 되는 약 70도에서 시작되어 원하는 DNA 서열이 복제됩니다. 이 과정을 반복함으로써, 원하는 DNA를 대량으로 빠르게 얻을 수 있습니다.
   
   

 

PCR 진행에 필요한 시약 (1): 효소

 

 

(1) DNA polymerase (DNA 중합효소)

 

Primer와 같이 넣어준 dNTP를 이용하여 extension 단계를 수행하는 역할을 합니다. 사용되는 polymerase는 여러 종류가 있지만, 주로 사용되는 종류로는 Taq 및 Pfu DNA polymerase가 있습니다.

1. Taq DNA polymerase
   
   고온의 환경을 가지고 있는 온천에서 서식하는 내열성 박테리아(Thermus aquaticus)에서 유래한 효소로 열에 안정적인 특성을 가지고 있어 PCR에 자주 사용되는 종류입니다. 하지만 복제 과정에서 필요한 교정 기능은 결핍되어 있어, 정확성보다는 효율성을 중요시하는 PCR 작업에 사용되고 있습니다.
   
   
2. Pfu DNA polymerase
   
   고온에서 생장하는 박테리아(pyroccocus furiosus)에서 분리한 효소이며, 3`-5` exonuclease 기능을 통한 교정 기능을 나타내고 있어, 정확성을 중요시하는 PCR 연구에 이용하고 있습니다.

 

2) Reverse transcripase (역전사효소)

RNA template를 바탕으로, 공급된 dNTP를 이용한 역전사를 통해 상보적인 DNA(cDNA)를 합성하는 역할을 합니다. 이렇게 합성된 cDNA를 이용하여 PCR을 진행하게 됩니다.

역전사효소의 종류는 조류 골수아세포증 바이러스(AMV) 역전사효소 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MulLV, MMLV) 역전사효소를 주로 사용합니다. AMV 역전사효소는 RNase H 활성을 가지고 있으며, MMLV는 상대적으로 없는 것이 특징입니다.

 

역전사 이후 합성된 cDNA에는 기질로 사용된 RNA가 결합되어 남아있는 경우가 있습니다. 이런 cDNA를 PCR 반응에 사용하면, primer가 annealing 단계에서 붙어 있는 RNA에 의해 결합하지 못하므로, RNase H가 없으면 PCR 효율이 떨어질 수 있습니다.

 

RNase H는 cDNA에 붙어 있는 RNA를 제거해 주는 역할을 하지만, 효소 활성이 너무 과할 경우 역전사과정에서 cDNA 합성에 방해가 될 수 있습니다.

 

 

2) PCR 진행에 필요한 시약 (2): 기타 기질

(1) DNA binding dye

기존 gel loading을 통해 분리하여, Etbr 염색을 형광으로 확인하는 방법에서, DNA에 직접 결합하는 형광 다이를 이용한 실시간 PCR 측정을 이용하는 방식을 도입(real time-PCR)할 수 있습니다. 사용하는 DNA binding dye는 주로 Sybergreen과 Taqman이 있습니다. 두 물질 모두 PCR에 의한 합성 산물이 증가함에 따라, 같이 증가하는 형광을 측정하는 원리로 사용됩니다.

 

1. Sybergreen
   
   SYBR Green은 이중 나선 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물집입니다. SYBR은 대부분의 이중 나선 DNA에 잘 결합하여, primer 설계 시 형광 리포터 시스템을 포함하거나, 형광 라벨링을 고려할 필요가 없어집니다.
   
   그렇기에 범용성이 넓어 가장 널리 쓰이고 있습니다. 하지만 반대로 primer에 의해 비특이적으로 발생하는 부수물에도 결합하는 단점이 있습니다. 
   
   
2. TaqMan
   
   TaqMan은 Taq DNA polymerase가 가지고 있는 기능인 5'-3' exonuclease에 의해서 활성화되는 기전을 가지고 있습니다. TaqMan은 5' 말단에는 형광단(fluorepore), 3' 말단에 형광을 흡수하는 quencher가 부착된 프로브이며, 프로브는 annealing 단계에서 DNA template에 부착됩니다.
   
   이후 Taq DNA polymerase가 작용하게 되면, 5'-3' exonuclease에 의해 부착된 프로브를 분리해 내게 되고, 이때 형광과 quencher가 떨어지면서 quencher에 의해 흡수된 형광 에너지를 방출하여, 형광 증가를 나타냅니다.
   
   이러한 특징 때문에, TaqMan을 이용하여 PCR을 진행할 때는, 일반적으로 프라이머의 Tm 보다 8-10°C 높은 온도에서 결합되도록, 5'-3' exonuclease 활성이 잘 나타나는 온도는 Tm 보다 낮은 온도에서 elongation을 진행하도록 설계됩니다. 

(2) dNTP

네 종류의 DNA 합성에 필요한 기질(dATP, dCTP, dGTP, dTTP: 각각 adenosine, cytosine, guanine, thymine)이 혼합되어 있는 시약입니다. 역전사효소는 RNA template에 상보적인 기질을 부착하여 cDNA를 합성합니다.

(3) MgCl2

Cofactor로써 효소의 기능을 향상해 주는 역할을 합니다. Mg+는 DNA polymerase의 효소 기능을 증가시켜, 증폭 속도를 빠르게 합니다. dNTP에 붙어, beta, gamma phosphate를 쉽게 제거할 수 있게 만들어 주어, template에 더 쉽게 합성되게 돕습니다.

 

 마침글

이상으로 PCR에 사용되는 시약에 대해서 알아보았습니다. 해당 내용을 알고 실험을 하시면, 주의해야 할 사항이 무엇인지 파악할 수 있을 겁니다. 이상으로 긴 글 읽어주셔서 감사합니다.

 

이상으로 PCR의 기본 원리와 다양한 형태에 대해 알아보았습니다. 이 기술은 생명 과학 연구와 진단 분야에서 매우 중요한 도구로, 그 활용도는 계속해서 확장되고 있습니다. 

 

본 글이 분자생물학 연구의 깊이 있는 이해에 도움이 되길 바랍니다. 감사합니다.